Nanobiodiagnostica
Ambientale

La tecnica analitica di microscopia elettronica che abbiamo sviluppato ci ha permesso di creare un nuovo metodo investigativo per valutare la presenza in qualunque mezzo, compresi i tessuti biologici, di corpi estranei sia micro- sia nano-dimensionati. Quindi, renderci conto dell'effettiva esposizione subita dal paziente a micro e nano-patogeni. L'identificazione, poi, della composizione chimica delle particelle trovate nei tessuti patologici, insieme con le loro dimensioni e la loro forma, ci ha spinto ad elaborare una nuova tipologia di anamnesi che coinvolge, di fatto, la vita del paziente, e ci ha indotto a cercare l’origine di quella specifica contaminazione, comprese le modalità con cui quella contaminazione potrebbe essere avvenuta. In alcuni casi, abbiamo notato che l'esposizione era ancora presente nell’ambiente dove il paziente viveva. Quindi, abbiamo fornito alcune indicazioni su come evitarla per non ricadere nella patologia, magari aggravandola.

Questo tipo di lavoro ci ha permesso di scoprire modi inaspettati di contaminazione e, spesso, meccanismi sconosciuti di diffusione delle particelle all'interno del corpo umano.

Di seguito, sono brevemente descritti tre casi in qualche modo analoghi selezionati dal Capitolo 4 del libro di Gatti e Montanari intitolato Nanopathology: the Health Impact of Nanoparticles, edito da PanStanford Publishing (Singapore), 2008, pp.1-298.

Un professore di matematica iniziò a manifestare alcuni problemi nell'articolare il suono "r", cosa fastidiosa e imbarazzante, specialmente durante le sue lezioni all'Università. Dopo vari esami neurologici, fu emessa una diagnosi di “Sindrome della Sclerosi Laterale Amiotrofica”, una diagnosi a cui il paziente non credeva e rifiutava di accettare.

Così, il professore iniziò a cercare su Internet informazioni sulla malattia e scoprì che uno dei primi e più comuni sintomi era una lieve zoppia, sintomo che, tra gli altri trovati in elenco, non stava sperimentando.

Nell'enorme quantità di informazioni non sempre affidabili trovate su Internet, lesse che una possibile causa della patologia poteva essere rappresentata da una contaminazione sistemica da amalgama dentale, a causa del suo contenuto di mercurio, elemento altamente tossico. Quindi, il professore chiese il parere del dott.ssa. Gatti, esperta di biomateriali e insegnante di Materiali Dentali presso l'Università di Modena e Reggio Emilia.

In realtà, il professore aveva in bocca sia otturazioni in amalgama sia protesi dentali, e soltanto in due denti l'amalgama non sembrava presentare corrosioni. Infatti, è solo durante il processo di corrosione che l'amalgama rilascia ioni dei suoi componenti, cioè mercurio, argento, stagno e rame, che possono essere tossici sia localmente a carico della mucosa orale sia in modo sistemico per inevitabile ingestione.

Un’attenta osservazione della bocca rivelò una situazione insolita: la superficie della lingua non appariva simmetrica, e la metà destra non era piatta come quella sinistra, ma era corrugata e ondulata. La mucosa sembrava avere una maggiore estensione rispetto alla parte sottostante, creando una sorta di gibbosità non aderente alla base della lingua. Sembrava che ci fosse uno scollamento tra il tessuto linguale e quello sottostante. Inoltre, notammo una decolorazione nella mucosa della guancia interna a livello dell'intersezione dei denti. Notammo pure che nella parte destra della bocca erano state impiantate alcune protesi di porcellana.

Osservato tutto ciò, facemmo una riflessione: se era presente un fenomeno di usura a carico delle protesi dentarie, ci doveva essere stato un rilascio di detriti nella bocca, ed un loro conseguente intrappolamento nella mucosa circostante: fenomeno questo che induce una reattività tissutale di una portata sufficiente da poter indurre una fibrosi. La mucosa della lingua ha una grande capacità di assorbimento, quindi, il passaggio di alcune particelle sottili attraverso di essa non poteva sorprenderci, e il loro intrappolamento avveniva a livello del substrato sottostante chiamato corium.
Una fibrosi produce un ispessimento tessutale che esita in una successiva contrazione delle fibre, fenomeno che potrebbe essere responsabile dello scollamento fra il tessuto superficiale della lingua ed il substrato, creando proprio una morfologia gibbosa della superficie della mucosa e la perdita di agilità della lingua.
È anche ragionevole pensare che tutto ciò eserciti una compressione sui muscoli e sui nervi sottostanti. Tuttavia, in ogni caso, una raccolta di corpi estranei può dare origine a una fibrosi, e una fibrosi localizzata potrebbe essere responsabile del problema nell'articolazione del suono "r", poiché un tessuto fibrotico è di norma meno elastico del normale e non consente movimenti fini e precisi.

Il primo passo che dovevamo compiere era dimostrare la presenza di questa fibrosi, includendo detriti protesici in una biopsia del lato interno della guancia. Di fatto, il tessuto presentava effettivamente una fibrosi e alcuni detriti di porcellana erano presenti.

Il secondo passo era dimostrare una presenza simile in una biopsia del lato destro della lingua. La speranza era che, se una reazione fibrotica dovuta a corpi estranei fosse stata presente, la rimozione di questo tessuto o un taglio sulla lingua avrebbe probabilmente potuto interrompere il fenomeno e il suo peggioramento. Pensavamo che fermare il progresso della fibrosi potesse prevenire danni ulteriori ai nervi e ai vasi sanguigni. Infatti, il restringimento di un tessuto fibrotico può causare l'ostruzione dei vasi e la conseguente interruzione dell'apporto di elementi nutritivi e di ossigeno. Le terminazioni nervose afferenti ed efferenti possono contemporaneamente interrompere la propagazione del segnale elettrico, causando l'apertura del circuito.

Mentre l'istopatologo confermava la presenza di una fibrosi nel campione bioptico, vedemmo alcuni precipitati di zinco, un ritrovamento allora insolito e inaspettato. È facile distinguere tra particelle esogene e precipitati endogeni: il segnale EDS è alto nel caso delle "rocce", poiché la struttura atomica è compatta, mentre nel caso dei precipitati, l'elemento inorganico (zinco in questo caso) è legato alle proteine, formando metalloproteine insolubili. La densità di questi precipitati è molto bassa e il segnale che emettono è basso di conseguenza (le proteine contengono carbonio, ossigeno, idrogeno e azoto, tutti elementi leggeri).

Nel nostro caso, gli ioni di zinco dovevano essere stati assorbiti dalla mucosa della lingua, e nella sottomucosa l'interazione con le proteine aveva creato precipitati insolubili. La sottomucosa è ricca di nervi e terminazioni nervose che possono essere compromessi dalla presenza di ioni tossici. Inoltre, la formazione di precipitati metallo-proteici può interferire con il metabolismo cellulare secondo meccanismi diversi: deplezione proteica, immobilizzazione delle proteine o un cambiamento nel pH locale. Un'altra possibilità è l'ingresso degli ioni all'interno della cellula dove questi possono precipitare, formando aggregati che disturbano il metabolismo intracellulare. Il sequestro di proteine, poi, cioè la formazione di precipitati insolubili, può interrompere le reazioni a cascata che innescano "soluzioni metaboliche alternative".

Quello che avevamo rilevato non si limitava solo a zinco, ma comprendeva una certa gamma di particelle con dimensioni comprese tra 0,8 e 20,2 micron. Erano presenti anche particelle d'oro, compatibili con le protesi portate dal paziente. Ed erano presenti pure particelle di silicio, alluminio, calcio, magnesio, potassio e ferro da 0,8 micron, e queste potrebbero certamente essere ritenute responsabili della fibrosi, della rugosità della superficie della lingua e della decolorazione della mucosa.
Ma ciò che ci sorprese maggiormente fu la presenza di zinco. Si tratta di un elemento metallico comunemente usato come ossido in ragione della sua attività antibatterica, ma la sua presenza all'interno della mucosa orale era inaspettata e richiedeva una spiegazione.

Come di consueto, interrogammo il paziente a proposito della sua dieta, dell'uso di gomme da masticare, di farmaci, ecc., ma non trovammo alcun indizio interessante. La verità emerse inaspettatamente quando interrogammo il paziente a proposito dei suoi appuntamenti dal dentista. Al paziente era stato consigliato di utilizzare per qualche giorno un collutorio, ma lui l'aveva usato in modo ossessivo, molte volte al giorno, per più di 3 anni. Sull'etichetta del prodotto era riportata la presenza di un sale di zinco come battericida, ma la soluzione conteneva anche alcol etilico, una sostanza che aumenta la permeabilità dell'epitelio della lingua, facilitando così il passaggio del sale. Questo sale si idrolizzava, lo zinco formava una metalloproteina e quella metalloproteina precipitava. La sua presenza era la causa probabile della necrosi parziale delle strutture biologiche presenti in quella zona.

Lo zinco, noto e impiegato come battericida, è tossico per le cellule. Pertanto, può interagire con la guaina mielinica dei nervi e danneggiarla. Quando ci rendemmo conto di tutto questo, il paziente aveva già smesso di usare il collutorio, ma i danni al suo sistema nervoso erano diventati irreversibili. Quindi, tutto quanto avevamo scoperto non gli servì a nulla, e morì in sei mesi.

Se la nostra ipotesi è corretta, si trattava di un caso in cui semplici misure precauzionali avrebbero potuto evitare le conseguenze più gravi, nel caso in questione tanto gravi da portare alla morte.

In questo caso, la paziente era una donna di 45 anni affetta da mesotelioma peritoneale per cui era stata sottoposta a un intervento chirurgico. Alcune campionature bioptiche del suo peritoneo ci erano state inviate per essere analizzate. In quei campioni trovammo parecchi detriti singolarmente disseminati, tra cui metalli come l'acciaio inossidabile. Ma una particolare composizione chimica attirò la nostra attenzione.
L’EDS indicava che una serie di particelle submicroniche erano un silicato contenente, tra gli altri elementi, uranio e torio. In quel periodo eravamo occupati con campioni provenienti da veterani italiani e francesi tornati dalla ex Jugoslavia, e in quei reperti cercavamo uranio, ma senza risultato: non c'era traccia di quel metallo nei tessuti patologici dei pazienti di cui ci occupavamo.
Ora ci trovavamo di fronte al caso di una donna che non era mai stata in una zona di guerra né, a sua conoscenza, vicino a una fonte di radioattività, ma aveva indiscutibilmente uranio e torio nel suo corpo. Quindi, iniziammo una ricerca mirata a identificare l'origine di queste particelle insolite e inaspettate.
Trattandosi di silicati, sospettammo subito che l'origine dell'inquinamento potesse essere localizzato entro un'area a circa 20 chilometri a sud del luogo in cui viveva la paziente, dove sono presenti diverse fabbriche di ceramica. Per quanto riguarda l'uranio, questo viene utilizzato per colorare gli smalti, e lo stesso vale per il torio. Lo studio dei venti che sarebbero stati i vettori dell’inquinamento, tuttavia, sembrava escludere l’ipotesi o, almeno, renderla molto improbabile.
Poiché queste particelle erano state trovate nel peritoneo, cioè anatomicamente vicino ad un tratto dell’apparato digerente, ipotizzammo come probabile, anche se non in via esclusiva, che l'ingestione potesse essere il modo in cui quelle sostanze erano state introdotte nell'organismo. In base a questa ipotesi, iniziammo a cercare il cibo che la paziente consumava più frequentemente, nonostante il fatto che ciò che si trovava nel peritoneo potesse essere entrato nel corpo con un cibo molto tempo prima, se il cibo era effettivamente il "cavallo di Troia", un cibo che era stato consumato in passato e poi dimenticato. Tuttavia, cercammo, perché nessuna pista va trascurata.
Tutta la famiglia, composta anche da marito e figlia, entrambi in buona salute, fu coinvolta in questa specie di caccia al tesoro. La paziente ci riferì che entrambi i suoi genitori erano morti di cancro al fegato, senza dubbio qualcosa su cui valeva la pena indagare, ma non riuscimmo a trovare le loro biopsie e, naturalmente, le registrazioni istopatologiche scritte non contenevano nulla che potesse aiutarci.
Interrogando la famiglia sulle loro preferenze alimentari, scoprimmo che la signora preferiva le verdure alla carne, questo a differenza del marito e della figlia, ed era particolarmente affezionata a un tipo di cicoria selvatica che i suoi genitori le portavano almeno una volta alla settimana da un villaggio in collina, situato a circa 40 chilometri dalla città dove la paziente si era trasferita all'età di 22 anni, quando si era sposata. Quella cicoria era un piatto usuale per lei fin dall'infanzia, e non aveva mai smesso di esserlo.
La cicoria selvatica era ciò che dovevamo verificare, così andammo nella piccola valle dove quella veniva sempre raccolta dai genitori. Quando andammo era inverno, e non era il periodo giusto per trovare cicoria in quel luogo né altre verdure commestibili, ma, cercando possibili indizi di inquinamento, vedemmo una colonna di fumo in lontananza e ci dirigemmo là, a quattro o cinque chilometri di distanza in linea d'aria. Lì c’era un gruppo di piccole fabbriche di ceramica di cui non conoscevamo l'esistenza.
Poi tornammo nella piccola valle e raccogliemmo alcune foglie di quercia ancora appese agli alberi e le portammo in laboratorio e per osservarle sotto l'ESEM. Sulle foglie rilevammo particelle contenenti composti silicatici con Uranio e Torio.
Secondo quanto avevamo scoperto, la signora e i suoi genitori avevano mangiato qualcosa che credevano essere molto sicuro ma che, in realtà, conteneva particelle tossiche (e pure leggermente radioattive).
Ora mancava un'ultima parte per completare il puzzle: perché la nostra paziente aveva contratto un mesotelioma peritoneale, mentre i suoi genitori erano morti di cancro al fegato (ammettendo che l'eziologia fosse la stessa)? Ventitré anni prima, la nostra paziente aveva trascorso la luna di miele nel deserto in Nord Africa e, quando era ospite di alcuni beduini, aveva contratto una febbre tifoide. I problemi intestinali erano durati a lungo e, probabilmente, quella condizione infiammatoria aveva alterato la permeabilità della sua mucosa intestinale, rendendola più raggiungibile dalle particelle.
Se accettiamo questa ipotesi, se la paziente avesse avuto un intestino sano, avrebbe probabilmente contratto non un mesotelioma ma un cancro al fegato, come era stato per i suoi genitori.

Un paio di pazienti abbastanza insoliti, due dottoresse che lavoravano nel reparto neonatale di un grande ospedale, vennero nel nostro laboratorio chiedendoci se potessimo aiutarle a risolvere il loro caso.
Quattro medici, tra cui il capo del reparto e due infermiere, soffrivano di sarcoidosi, e mancavano loro due diagnosi, poiché gli operatori sviluppavano sintomi che non potevano essere ricondotti a nessuna malattia conosciuta.
Una delle due pazienti sofferente di sarcoidosi polmonare mostrava all'interno delle formazioni granulomatose tipiche di quella malattia micro- e nanoparticelle di silicati e acciaio inossidabile.
Il secondo caso era diverso. Il medico-paziente aveva contratto un'infezione batterica al dito anulare della mano sinistra, un'infezione che si era dimostrata resistente all'antibiotico specifico somministrato. I batteri dichiarati responsabili erano stati rilevati all'interno dell'Unità di Terapia Intensiva del reparto, dove la paziente era solitamente occupata.
In breve tempo, la paziente aveva cominciato a soffrire di affaticamento, seguito da episodi acuti di dolori talvolta monolaterali e talvolta bilaterali agli arti inferiori, seguiti, a loro volta, dalla formazione di noduli che erano stati rimossi chirurgicamente ben 18 volte senza alcun vantaggio per la paziente, dato che la patologia continuava a progredire. Le nostre indagini su quei noduli scoprirono la presenza di particelle di acciaio inossidabile e alluminio. Una sezione di quei noduli fu inviata alla Harvard School of Medicine a Boston, e la diagnosi emessa fu di vasculite.
La nostra ipotesi era che si fossero verificati fenomeni di extravasazione di queste particelle circolanti nel sistema circolatorio, e ciò avrebbe potuto spiegare il dolore acuto. Successivamente, la presenza di corpi estranei nel tessuto muscolare avrebbe ragionevolmente indotto la reazione biologica che aveva portato alla formazione dei noduli.
Dovevamo cercare la fonte di inquinamento che poteva aver causato le patologie nei medici che stavano vivendo ciò che per i medici è una vita normale.
Quindi, decidemmo di prelevare campioni dell'aria in due stanze adiacenti dove i medici lavoravano più frequentemente, e lo facemmo mediante una pompa d'aria che restò in funzione per un'ora. L’aria fu fatta passare su filtri di cellulosa dove, al microscopio elettronico, individuammo particelle più piccole di 2,5 micron.
Ci fu detto che proprio fuori dell'edificio dove si trovava il reparto sorgeva fino a poco tempo prima un altro edificio che era stato demolito molto lentamente, sollevando grandi nuvole di polvere. L'armatura in acciaio ancora in piedi era poi stata lasciata a lungo sul posto.
L'inquinamento polveroso creato dai lavori di abbattimento era stato aspirato dal sistema di condizionamento dell'aria installato sul tetto del reparto, ed ogni stanza era dotata di un sistema di filtrazione capace di bloccare solo particelle più grandi di 2,5 micron, mentre le particelle più piccole potevano passare facilmente, e la loro presenza all'interno delle stanze si era concentrata a causa di un sistema di ricircolo che aveva creato un accumulo di inquinanti fini.
È naturale che chiunque lavori in condizioni ambientali simili sia esposto agli effetti di quel tipo di inquinamento.
La differenza principale tra i due casi era la presenza molto più assidua e regolare del secondo medico nell'Unità di Terapia Intensiva, dove era stata trovata una contaminazione batterica, e questi batteri erano a loro volta contaminati con alluminio, servendo da vettori. Le particelle di alluminio si trovavano all'interno dei batteri che avevamo trovato, e quella presenza, voluminosa per quelle dimensioni, ne cambiava la morfologia. È probabilmente per quel cambiamento di forma che gli antibiotici somministrati non avevano l’effetto aspettato.
Nel primo caso, la reazione granulomatosa era stata predominante, mentre nel secondo caso a predominare era il vettore infettivo dell'inquinamento.

I casi proposti e le soluzioni trovate dovrebbero farci riflettere. La soluzione dei casi gemelli era stata possibile perché avevamo iniziato cercando e trovando la reale esposizione a cui il paziente era stato sottoposto. Ogni paziente ha una storia personale, e gli studi epidemiologici non sono sempre utili o, addirittura, non hanno alcun significato se il numero di casi in questione è molto limitato. Quindi, in circostanze simili, dovrebbe essere condotta un'indagine "personalizzata" orientata verso il singolo paziente. L’approccio è certamente lontano dall'essere facile, è costoso e richiede tempo: tutte cose che la nostra società non sembra essere disposta ad accettare, ma non vediamo altre vie per affrontare pazienti come quelli con cui ci siamo confrontati e continuiamo a confrontarci.

Anche se difficile, costoso in termini di denaro e dispendioso in termini di tempo, quell’approccio non è affatto inutile. La conoscenza acquisita da casi simili è della massima utilità per preparare linee guida sulla prevenzione e, in modo molto pragmatico, prevenire significa risparmiare denaro, oltre che rendere più probabile la soluzione del caso.

Negli eventi brevemente descritti, abbiamo ottenuto un’ulteriore prova che qualsiasi rilascio incontrollato di nanoparticelle non importa dove, ma nei luoghi di lavoro in particolare, deve essere evitato. Maschere idonee, mezzi di filtrazione specifici e sistemi efficaci per abbattere l'inquinamento da polveri acuto, soprattutto quando queste hanno dimensioni nanometriche, devono essere studiati e prontamente adottati. Quando la polvere viene rilasciata nell'ambiente, tutti devono prendere le debite precauzioni. Indicare come farlo è compito dello scienziato.